微卫星不稳定性状态可作为肿瘤化疗敏感性的预测生物标志物

当前，估计全球每年有960万人死于癌症，占总死亡人数的六分之一。由于几乎所有具有增殖能力的细胞都有癌变的可能性，这导致数百种肿瘤类型的发生；随着前沿分子水平分类方法学的发展，人们也识别出了更多的肿瘤亚型。鉴于肿瘤发生在基因组水平上的随机性和不同肿瘤之间的异质性，对于绝大多数肿瘤来说，完全预防几乎是不可能的，并且很难针对每种肿瘤亚型设计特异性且有效的治疗药物。即使最新的靶向疗法和免疫疗法，它们对绝大多数肿瘤也无效，特别是对于不可切除的、倾向于发生全身扩散的中晚期肿瘤。目前化疗具有非选择性杀伤作用和较强的细胞毒性，仍然是改善患者预后甚至挽救患者生命的最重要治疗方法。

      然而，耐药性是癌症化疗的一个关键挑战。耐药性的原因多种多样。癌症异质性往往会影响化疗的有效性，因此，实现精准化疗很重要。随着新的化疗药物和治疗方法越来越多，迫切需要找到一种普遍适用于多种药物的预测性标志物，在治疗前预测癌症患者的化学敏感性以改善他们的预后。

方法学

从公共数据库下载数据，比较高微卫星不稳定性（MSI-H）和微卫星稳定/低微卫星不稳定性（MSS/MSI-L）组的药物敏感性。此外，本文还进行了通路富集分析和细胞化学敏感性测定，以探索MSI状态可能影响药物敏感性的机制，并评估了药物处理细胞系和对照细胞系之间的差异。

结论

      MSI-H多发性肿瘤患者对多种化疗药物的敏感性高于MSS/MSI-L患者，特别是对于CRC，其通过下调DDR通路（如NHEJ）增强了化疗敏感性。同时化疗药物引起的额外DNA损伤导致DDR通路进一步下调，增强药物敏感性，形成了HIS-H患者对化疗药物敏感性增加的正循环。

结果 1

MSI 状态与癌症化疗敏感性之间的关系

      GDSC数据库中的肿瘤细胞系分为MSI-H组和MSS/MSI-L组。Mann-Whitney U 检验显示 MSI 状态与化疗药物 IC50 对 CRC、STAD、OV 和 UCEC 有显著相关性。除紫杉醇外，所有化疗药物在 MSI-H CRC 细胞系的 IC50 值均显著低于 MSS/MSI-L 细胞系。这表明 MSI-H CRC 细胞系比 MSS/MSI-L 细胞系对多种化疗药物更敏感，包括 5-FU、奥沙利铂和伊立替康，这些药物均包含在标准 CRC 化疗方案中。此外，与DNA损伤相关的化疗药物，如奥沙利铂、米托蒽醌、5-FU、顺铂和吉西他滨，与其他类别的化疗药物相比，MSI-H组和MSS/MSI-L组的IC50值差异更显著（p < 0.01）。然后，本文根据患者的MSI状态预测了TCGA数据库中患者对化疗的反应。MSI-H 组和 MSS/MSI-L 组对以下癌症对某些化疗药物的预测敏感性存在显着差异：CRC、STAD、UCEC、子宫癌 （UCS）、前列腺腺癌 （PRAD）、乳腺浸润癌 （BRCA）、头颈部鳞状细胞癌 （HNSC）、肾肾透明细胞癌 （KIRC）、肺鳞状细胞癌 （LUSC）、肝肝细胞癌 （LIHC）、 食管癌 （ESCA）、皮肤黑色素瘤 （SKCM） 和肉瘤 （SARC） （下图C）。预测的药物敏感性结果与基于GDSC CRC数据集分析的IC50结果一致。为了进一步证明 MSI 作为基于化疗敏感性分层的生物标志物的实际意义，本文对 GEO 数据库中的 25 个 CRC 表达谱进行了荟萃分析，以预测具有不同 MSI 状态的细胞系的化疗敏感性。与之前的GDSC数据库分析一样，结果显示MSI-H CRC组细胞系的IC50值显著降低（logFC<0,95%CI<0，下图F），比 MSS/MSI-L CRC 组中的细胞系对除紫杉醇、多柔比星和依托泊苷之外的几乎所有化疗药物都更敏感。这些结果表明，MSI 状态是多种癌症化疗药物敏感性的预测标志物，包括 CRC、STAD、LIHC、ESCA、OV、UCEC、UCS、PRAD、BRCA、DLBC、HNSC、KIRC、LUSC、LIHC、ESCA、SKCM 和 SARC，在大多数情况下，MSI-H 表示更高的化学敏感性。

结果 2

在不同MSI状态的COAD细胞中分析化疗药物IC50

      为了进一步验证不同MSI状态的COAD细胞对多种化疗药物的敏感性，本文测定了两种MSI-H COAD细胞系（RKO和HCT116）和两种MSS/MSI-L COAD细胞系（HT29和SW620）中五种化疗药物的IC50值。对于伊立替康和奥沙利铂，MSI-H COAD细胞的IC50值低于MSS/MSI-L COAD细胞（下图A和B）。对于顺铂和多柔比星，RKO 和 HCT116 细胞的化学敏感性高于 HT29 细胞，但化学敏感性低于 SW620 细胞（下图C和D）。MSI-H和MSS/MSI-L COAD细胞系之间的5-FU IC50值差异无统计学意义（下图E）。

结果 3

MSI状态与DDR通路的关系及其对泛癌种患者的预后意义

      进一步探讨DDR通路在MSI-H和MSS/MSI-L肿瘤化疗反应中的作用。本文首先通过GSEA分析TCGA的CRC队列。碱基切除修复 （BER）、范可尼贫血 （FA）、核苷酸切除修复 （NER）、NHEJ 和单链断裂 （SSB） 通路是 DDR 通路，在 MSI-H CRC 中显著下调，在 MSS/MSI-L CRC 中显著上调（下图A）。NCI-60的OV细胞系数据也被分为MSI-H组和MSS/MSI-L组。BER 和 NHEJ 通路在 MSI-H 组中显著下调，在 MSS/MSI-L 组中显著富集。本文将泛癌样本分为 MSI-H 和 MSS/MSI-L 组，GSEA 的 MANTIS 评分临界值为 0.4。观察到 MSI 状态与 PRAD 和 UCEC 的多种 DDR 通路之间存在显着但相反的相关性，并且在许多肿瘤中，尤其是 在CRC 和 OV，NHEJ 和 BER 通路与 MSI 状态显着相关。接下来，本文进一步探讨了这些DDR通路在患者预后中的作用。在从TCGA泛癌队列表达数据中获得的ssGSEA评分的单因素Cox回归分析中，发现DDR通路与患者预后之间的关联与肿瘤类型密切相关（下图B和C）。例如，在UCEC等肿瘤中，DDR通路富集通常是一个危险因素，而在STAD等其他肿瘤中，多个DDR通路是显著的保护因素。一般来说，NHEJ通路的下调可能是MSI-H CRC化疗敏感性的重要机制，NHEJ的上调可能通过抑制肿瘤发展对患者的预后起积极作用。

结果 4

CRC中MSI状态在DDR和化学敏感性之间的作用

      本文分析了GDSCCRC队列（总体组）中DDR通路ssGSEA评分与DDR相关药物ln（IC50）值的相关性。DDR通路ssGSEA评分与化疗药物的ln（IC50）呈显著正相关（下图A）。除替尼泊苷和米托蒽醌外，NHEJ通路与所有DNA损伤反应化疗药物的ln（IC50）值均表现出强烈而显著的相关性（R>0.3，p值<0.05）。这表明 DDR 通路的上调与化疗耐药性有关，而 DDR 通路的下调与化疗敏感性有关。当进一步将CRC队列分为MSI-H和MSS/MSI-L组时，总体而言，MSS/MSI-L组的DDR通路ssGSEA评分与细胞系的ln（IC50）值之间的关系与MSS/MSI-L组的关系更一致（下图B）。MSI-H组NHEJ通路富集与药物敏感性的关系与整体组更相似（下图C），进一步表明了NHEJ通路在MSI-H CRC的高药敏性中的作用。在PRAD中，DDR通路ssGSEA评分与ln（IC50）呈负相关;特别是，MSI-H组FA和SSB通路的上调与喜树碱的ln（IC50）呈负相关，这可能解释了与MSS/MSI-L PRAD相比，MSI-H PRAD对喜树碱的敏感性更高。同样，UCEC中NHEJ通路GSEA评分与博来霉素ln（IC50）值呈负相关;MSI-H 组中 NHEJ 的上调可以解释为什么 MSI-H UCEC 对博来霉素的敏感性高于 MSS/MSI-L UCEC。这些发现表明，DDR通路可以在一定程度上解释某些肿瘤（如UCEC和PRAD）对某些DNA损伤相关化疗药物的敏感性增加。DDR途径在MSI-H CRC药物敏感性中的作用就是最好的例证。在 CRC 中，MSI-H 状态可能通过下调 DDR 通路（尤其是 NHEJ）介导对各种化疗药物的敏感性增强。

结果 5

MSI-H阳性结直肠癌患者，对化疗药物的敏感性增加

      在确定 CRC 中的 MSI-H 状态可能通过下调 NHEJ 通路来增强对 DDR 相关化疗药物的敏感性后，本文进一步探索了 CRC 中 DDR 通路的变化和化疗药物治疗后的化学敏感性。首先将NCI-60panel中的泛癌细胞系分为治疗组和对照组，计算了DDR通路ssGSEA评分，并分析了六种不同化疗药物治疗前后泛癌细胞系DDR通路ssGSEA评分的差异。在GEO中用八种DDR相关化疗药物（顺铂、拓扑替康、5-氮杂胞苷、多柔比星和吉西他滨）处理细胞：GSE116436，在大多数情况下，治疗组的所有八种 DDR 通路都显示出比对照组更强的富集程度（下图A）。在COAD中，几乎所有的DDR通路在用所有药物治疗后都显著下调（下图B）;这一趋势在总体、MSI-H 和 MSS/MSI-L 组之间没有显着差异 （下图C和D），表明这种影响可能与 MSI 状态无关。然而，值得注意的是，在用紫杉醇、顺铂、拓扑替康、多柔比星和吉西他滨治疗后，COAD 中的 NHEJ 通路显着下调。

结果 6

DDR 抑制剂影响 MSI-H COAD 细胞中化疗药物的 IC50 值

      本文发现RKO和HCT116细胞对伊立替康和奥沙利铂比 HT29和SW620细胞更敏感。因此，选择研究DDR通路抑制剂对COAD细胞中伊立替康和奥沙利铂IC50值的影响。首先，我们测量了 UNC-2170（一种 DDR 抑制剂）在通过 CCK-8 测定处理 24 小时的四种 COAD 菌株中的 IC50 值。UNC-2170单独使用没有显着抑制COAD细胞的生长。因此，为了研究 DDR 抑制剂和化疗药物在 COAD 细胞中的联合作用，选择了两种固定浓度的 UNC-2170（2 μg/mL 和 20 μg/mL）。在 RKO 细胞中，添加低剂量 （2 μg/mL） 或高剂量 （20 μg/mL） 的 UNC-2170 可增加对伊立替康的敏感性。奥沙利铂联合DDR抑制剂（20 μg/mL）的IC50值显著低于其他两个治疗组（单独使用奥沙利铂和奥沙利铂联合DDR抑制剂（2 μg/mL））（下图A）。在 HCT116 细胞中，高剂量的 DDR 抑制剂 （20 μg/mL） 增加了对奥沙利铂的敏感性。我们还发现，随着DDR抑制剂浓度的增加，HCT116细胞对伊立替康的敏感性逐渐增加，组间IC50值差异显著（下图B）。DDR抑制剂不影响HT29细胞对奥沙利铂的敏感性。相反，当DDR抑制剂与伊立替康联合使用时，伊立替康的IC50明显低于单独使用伊立替康组，但不同浓度DDR抑制剂组的IC50差异无统计学意义（下图C）。对于SW620细胞，DDR抑制剂对化疗药物的敏感性无影响，奥沙利铂和伊立替康治疗组的IC50差异无统计学意义（下图6D）。

参考文献

Ye T, Lin A, Qiu Z, Hu S, Zhou C, Liu Z, Cheng Q, Zhang J, Luo P. Microsatellite instability states serve as predictive biomarkers for tumors chemotherapy sensitivity. iScience. 2023 Jun 7;26(7):107045. doi: 10.1016/j.isci.2023.107045. PMID: 37448561; PMCID: PMC10336167.

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