原料乳及乳制品中三聚氰胺检测方法验证报告
GB/T22388-2008(第一法)
李晓东
一、
方法概述
1 范围本标准规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定方法。
本标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定。
2 原理试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取,经阳离子交换固相萃取柱净化后,用高效液相色谱测定,外标法定量。
二、
仪器与试剂1.仪器
1.1高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器
1.2分析天平:感量0.0001g和0.01g
1.3固相萃取装置
1.4超声波振荡器
1.5氮气吹干仪
1.6涡旋混合器
1.7高速离心机:转速不低于4000r/min。
1.8具塞塑料离心管
1.9研钵
2. 试剂
除非另有说明,本方法所有实际均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
2.1甲醇(CH3OH ):色谱纯。
2.2乙腈(CH3CN) : 色谱纯。
2.3氨水:含量25%-28%
2.4三氯乙酸
2.5柠檬酸
2.6辛烷磺酸钠
2.7甲醇水溶液:准确量取50ml甲醇和50ml水,混匀后备用。
2.8三氯乙酸溶液(1%):准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混匀后备用。
2.9氨化甲醇溶液(5%):准确量取5ml氨水和95ml甲醇,混匀后备用。
2.10离子对缓冲液:准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠,加入约960ml水溶解,调节PH至3.0后,定容至1L备用。
3. 材料
3.1阳离子交换固相萃取柱:混合型阳离子交换萃取柱,基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物,60mg,3ml,或相当者。使用前依次用3ml甲醇、5ml水活化。
3.2定性滤纸
3.3海沙:化学纯,粒度0.65mm~0.85mm,二氧化硅(SiO
2)含量为99%。
3.4微孔滤膜:0.2μm,有机相。
3.5氮气:纯度≥99.999%
三、
分析步骤1.标准曲线绘制
1.1 三聚氰胺标品:纯度大于99.9%
1.2标准储备液:准确称取100mg(精确到0.1mg)三聚氰胺标准品于100ml容量瓶中,用甲醇水溶解并定容至刻度,配置成浓度为1mg/ml的标准储备液,于4℃避光保存。
1.3标准工作液:量取标准储备液适量,用甲醇水稀释成浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mLng/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL标准工作液。
2.样品的处理
2.1 提取
2.1.1液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
称取2g(精确至0.01g)试样于50ml具塞塑料离心管中,加入15ml三氯乙酸溶液和5ml乙腈,超声提取10min后,以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后,用三氯乙酸溶液定容至25ml,移取5ml
滤液,加入5ml水混匀后做待净化液。
2.1.2 奶酪、奶油和巧克力等
称取2g(精确至0.01g)试样于研钵中,加入适量海沙(式样质量的4倍-6倍)研磨成干粉状,转移至50ml具塞塑料离心管中,用15ml三氯乙酸溶液分数次清洗研钵,清洗液转入离心管中,再往离心管中加入5ml乙腈,余下操作同2.1.1中“超声提取10min,.......加入5ml水混匀后做待净化液”。
(注:若样品中脂肪含量较高,可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化)
2.2 净化
将3.1中的待净化液转移至固相萃取柱中,依次用3ml水喝3ml甲醇洗涤,抽至净干后用6ml氨化甲醇溶液洗脱,整个固相萃取过程流速不超过1ml/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干,残留物(相当于0.4g样品)用1ml流动相定容,涡旋混合1min,过微孔滤膜后,供液相测试。
3.仪器测定条件
3.1色谱柱:C8柱,250mm×4.6mm,5μm,或相当者;
C18柱, 250mm×4.6mm,5μm,或相当者。
3.2流动相:C8柱,离子对试剂缓冲液-乙腈(85:15,体积比),混匀。
C18柱,离子对试剂缓冲剂-乙腈(90:10,体积比),混匀。
3.3流速:1.0ml/min
3.4柱温:40℃
3.5波长:240nm
3.6进样量:20μl
四、
结果处理分析结果的表述
1、计算公式[img=,375,134]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807281407480482_5351_2904018_3.png!w375x134.jpg[/img]
式中:X-试样中三聚氰胺的含量mg/kg;
C-标准溶液中三聚氰胺的浓度,μg/mL;
m-试样质量,g;
V-试样最终定容体积,mL;
f-稀释倍数。
五、验证结果
1.线性结果
将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中, 测定相应的峰面积,以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
Y=38040.6*X+2468.64 R^2=0.9999026
[img=,690,434]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807281406375072_4673_2904018_3.png!w690x434.jpg[/img]
表1 三聚氰胺标准系列试验结果
C(μg/mL) | 0.5 | 1.0 | 5.0 | 10.0 | 25.0 | 50.0 | 100.0 |
A | 32622 | 45831 | 178263 | 374953 | 971711 | 1886106 | 3812576 |
以上结果表明三聚氰胺在0.5μg/mL ~100.0μg/mL范围内,R=0.9999513,吸光值与浓度呈线性关系,线性良好,符合要求。
2.检出限结果
将0.5μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=3±1,得出三聚氰胺的方法检出限为 0.1mg/kg
,此检出限结果满足条件。
七、重复性测定A.对样品F1807000285进行7次进样,其三聚氰胺测试值如下表所示:
编号 | m(g) | C(μg/ml) | V(ml) | X(mg/kg) | X平(mg/kg) | RSD(%) |
1 | 2.0231 | 11.609 | 1 | 28.69 | 28.85 | 0.33 |
2 | 2.0286 | 11.701 | 1 | 28.84 |
3 | 2.0304 | 11.747 | 1 | 28.93 |
4 | 2.0294 | 11.691 | 1 | 28.8 |
5 | 2.0300 | 11.745 | 1 | 28.93 |
6 | 2.0318 | 11.766 | 1 | 28.95 |
7 | 2.0272 | 11.677 | 1 | 28.85 |
本方法的精密度为 0.33% ,符合《原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定方法》GB/T22388-2008中给出的精密度要求。因此,本次测定均符合要求。
六、准确度验证(加标回收)对样品JF180401228加标,取三聚氰胺浓度100 .0 μg/mL的标液 0.12mL、0.20mL和0.4ml同样品同步处理后,结果见下表
测定编号 |
三聚氰胺 |
序号 | m(g) | V(mL) | C(μg/mL) | X(mg/kg) | X平(mg/kg) | 加标量() | 回收率% |
1# | 2.0211 | 1.0 | N.D | N.D | N.D | / | / |
2# | 2.0187 | 1.0 | N.D | N.D | / | / |
加标1# | 2.0236 | 1.0 | 11.747 | 29.03 | / | 24.71 | 97.91 |
加标2# | 2.0224 | 1.0 | 20.491 | 50.66 | / | 49.45 | 102.45 |
加标3# | 2.0312 | 1.0 | 38.246 | 94.15 | / | 98.46 | 95.62 |
由上表可以看出三聚氰胺的加标回收范围在 95.62%-117.48% ,RSD值为3.5%符合规定要求。
七、总结
本方法的检出限为0.1mg/kg。小于GB/T22388-2008中给出的最低检出浓度2mg/kg。本方法的精密度为 0.33%,符合《原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定方法》GB/T22388-2008中给出的精密度要求.通过对原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺测定方法的检出限、精密度和准确度的评价,本方法测定三聚氰胺数据准确,结果可信。此方法的准确性好,测定结果真实可靠,可用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定。
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