肉苁蓉含量测定方法验证
1
范围本方法适用于中药材及其中药饮片中含量的测定。
2
规范性文件本方法依据《中国药典》2015版四部通则0512
3
原理采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品由流动相带入色谱柱内,各组分在柱内被分离,并进入检测器检测,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
4
试剂和材料4.1 甲酸:分析纯。
4.2 甲醇:色谱纯。
4.3 0.1%甲酸溶液:量取甲酸1.0mL用水定容到1000mL。
4.4 松果菊苷(中国食品药品检定研究院 批号:111670-201706)。
4.5毛蕊花糖苷(中国食品药品检定研究院 批号:111530-201713)。
5
仪器和设备5.1高效液相色谱仪
5.2色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(C18,250mm×4.6mm,5μm)
5.3流动相:甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)(梯度洗脱)
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0-17 | 26.5 | 73.5 |
17-20 | 26.5-29.5 | 73.5-70.5 |
20-27 | 29.5 | 70.5 |
5.4检测波长:330nm
5.5柱温:25℃
6 试样处理称取样品粉末(过四号筛)约1.0g,精密称定,置100mL棕色容量瓶中,精密加入50%甲醇50mL,密塞,摇匀,称定重量,浸泡30min,超声处理(功率250W,频率35KHz)40min ,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,静置,取上清液,滤过,取续滤液,即得。
7 标准曲线绘制7.1 标准曲线绘制:
松果菊苷标准储备液:950.0μg/mL。
毛蕊花糖苷标准储备液:1009.0μg/mL
标准使用液:吸取松果菊苷,毛蕊花糖苷标准储备液于10mL容量瓶中,加50%甲醇至刻度。稀释成松果菊苷浓度4.75μg/ml、9.5μg/ml、23.75μg/ml、47.5μg/ml、95.0μg/ml、237.5μg/ml、475.0μg/ml、950.0μg/ml标准使用液和毛蕊花糖苷浓度5.045μg/ml,10.09μg/ml,25.225μg/ml,50.45μg/ml,100.9μg/ml,252.25μg/ml,504.5μg/ml,,1009.0μg/ml标准使用液。
8、结果处理试样松果菊苷,毛蕊花糖苷含量按下式进行计算:
X(%)= | C×V×f×100 |
m×1000×1000 |
式中:X-试样中松果菊苷,毛蕊花糖苷含量,单位为百分之(%);
C-由标准曲线得出松果菊苷,毛蕊花糖苷的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
m-试样质量,单位为克(g);
V-试样的最终定容体积,单位为毫升(mL)。
9、验证结果1.线性结果
A.将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
毛蕊花糖苷
Y=6421.45*X-34072.1 R^2=0.9996350表1 毛蕊花糖苷标准系列试验结果
C(μg/mL) | 5.045 | 10.09 | 25.225 | 50.45 | 100.9 | 252.25 | 504.5 | 1009.0 |
A | 37546 | 68673 | 117658 | 300638 | 604254 | 1546034 | 3128754 | 6493599 |
以上结果表明毛蕊花糖苷在5.045μg/mL ~1009.0μg/mL范围内,R=0.9998175,吸光值与浓度呈线性关系,线性良好,符合要求。
B.将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
松果菊苷
Y=11280.5*X-4686.25 R^2= 0.9999800
C(μg/mL) | 4.75 | 9.5 | 23.75 | 47.5 | 95.0 | 237.5 | 475.0 | 950.0 |
A | 59668 | 103253 | 269389 | 528208 | 1033552 | 2679041 | 5377342 | 10702002 |
以上结果表明松果菊苷在4.75μg/mL ~950.0μg/mL范围内,R=0.9999900,吸光值与浓度呈线性关系,线性良好,符合要求。
2.检出限结果
A.将5.45μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=3±1,得出毛蕊花糖苷的方法检出限为0.0006%
,此检出限结果满足条件。
B.将4.75μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=3±1,得出松果菊苷的方法检出限为0.00045%
,此检出限结果满足条件
10、重复性测定A.对样品JF180401230进行8次进样,其毛蕊花糖苷测试值如下表所示:
编号 | 质量(g) | 浓度(μg/ml) | 含量(%) | 平均含量(%) | RSD(%) |
1 | 1.0017 | 204.720 | 1.02 | 1.02 | 0.35 |
2 | 1.0021 | 204.631 | 1.02 |
3 | 1.0032 | 204.549 | 1.02 |
4 | 1.0067 | 204.379 | 1.02 |
5 | 1.0061 | 204.196 | 1.01 |
6 | 1.0057 | 204.265 | 1.02 |
7 | 1.0108 | 204.418 | 1.01 |
8 | 1.0055 | 204.355 | 1.02 |
本方法的精密度为0.35%,,符合《中国药典》2015版中给出的精密度要求。因此,本次测定均符合要求。
B.对样品JF180401230进行8次进样,其松果菊苷测试值如下表所示:
编号 | 质量(g) | 浓度(μg/ml) | 含量(%) | 平均含量(%) | RSD(%) |
1 | 1.0017 | 677.740 | 3.38 | 3.37 | 0.30 |
2 | 1.0021 | 677.031 | 3.38 |
3 | 1.0032 | 677.556 | 3.38 |
4 | 1.0067 | 677.186 | 3.36 |
5 | 1.0061 | 677.952 | 3.37 |
6 | 1.0057 | 677.323 | 3.37 |
7 | 1.0108 | 677.255 | 3.35 |
8 | 1.0055 | 677.459 | 3.37 |
本方法的精密度为0.30%,,符合《中国药典》2015版中给出的精密度要求。因此,本次测定均符合要求。
11、准确度验证(加标回收)A.对样品JF180401230加标,取毛蕊花糖苷浓度1009.0 μg/mL的标液0.22 mL、0.65ml同样品同步处理后,结果见下表
测定编号 |
毛蕊花糖苷 |
序号 | m(g) | V(mL) | C(μg/mL) | 含量(%) | 平均值(%) | 加标量(%) | 回收率% |
1# | 1.0031 | 50.0 | 204.803 | 1.02 | 1.02 | / | / |
2# | 1.0042 | 50.0 | 204.19 | 1.02 | / | / |
加标1# | 1.0026 | 50.0 | 208.173 | 1.04 | / | 0.022 | 90.9 |
加标2# | 1.0053 | 50.0 | 216.309 | 1.08 | / | 0.065 | 92.3 |
由上表可以看出毛蕊花糖苷测定的加标回收范围在90.9%-92.3% ,RSD值为1.08%符合规定要求。
B.对样品JF180401230加标,取松果菊苷浓度950.0 μg/mL的标液0.22 mL、0.65 mL同样品同步处理后,结果见下表
测定编号 |
松果菊苷 |
序号 | m(g) | V(mL) | C(μg/mL) | 含量(%) | 平均值(%) | 加标量(%) | 回收率% |
1# | 1.0031 | 50.0 | 677.695 | 3.38 | 3.38 | / | / |
2# | 1.0042 | 50.0 | 677.488 | 3.37 | / | / |
加标1# | 1.0026 | 50.0 | 681.141 | 3.40 | / | 0.021 | 95.2 |
加标2# | 1.0053 | 50.0 | 690.681 | 3.44 | / | 0.061 | 98.4 |
由上表可以看出松果菊苷测定的加标回收范围在 95.2%-98.4% ,RSD值为2.21%符合规定要求。
12、专属性对样品和阴性对照样品进行同样的方法处理,在同样的条件下上机,得出如下图谱所示:
阴性对照样品图谱 样品图谱通过对样品和阴性对照样品的上机比较,此方法符合要求。
13、耐用性柱温:30℃
通过对液相高效色谱仪柱温的改变,其他条件不变的环境下对样品进行上机,结果变化,如图
温度改变后温度改变前
14、总结.本方法从检出限、线性范围、重复性、回收率、专属性、耐用性进行测试,测试结果可知,均符合方法要求,本实验方法符合《中国药典》2015版要求。
维权声明:本文为T130554原创作品,本作者与(仪器信息网/我要测网)是该作品合法使用者,该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为,我们将追究法律责任。
评论