众所周知，目前为止容器密封完整性测试没有一个能够被业内接受的统一方法和标准，没有一个方法是能够很好适合产品的整个生命周期，而微生物侵入实验是现阶段比较主流稳定的选择。

明捷医药包材研究平台已构建完成2000多种可提取物质数据库，服务了千余家化药、生物药客户，有着丰富的项目经验。本期将为您重点剖析微生物侵入实验的两种途径。

在密封性（CCIT）的研究中，微生物侵入实验的目的为探查微生物侵入的风险孔径和直接用微生物侵入作为CCIT的检查手段。因目的不同则其试验条件应做适当区分。

《化学药品注射剂包装系统密封性研究技术指南（试行）》中提及：如方法灵敏度无法达到产品最大允许泄漏限度水平或产品最大允许泄漏限度不明确，建议至少采用两种方法（其中一种推荐微生物挑战法）进行密封性研究，对两种方法的灵敏度进行比较研究。

CDE指南进一步明确：密封性检查方法需进行适当的方法学验证。重点关注方法灵敏度的考察，通过挑战性重复测试存在和不存在泄漏缺陷的包装确认方法灵敏度。

灵敏度是指方法能够可靠检测的最小泄漏率或泄漏尺寸，目的在于找出微生物侵入或其它泄漏风险与泄漏孔隙类型/尺寸之间的关系，进而明确检测方法的检出能力。

对于无需维持顶空气体的刚性包装，可采用6×10-6mbar·L/s的最大允许泄漏限度值，相当于直径介于0.1~0.3μm的孔隙，选择这个保守的最大允许泄漏限度可确保较低风险的微生物侵入或液体泄漏，可不进行用于表征漏洞尺寸的额外的微生物或液体侵入挑战研究。

最大允许泄漏限度（Maximum allowable leakage limit，MALL）

是指产品允许的最大泄漏率或泄漏尺寸，即在这个泄漏率或泄漏尺寸下，不存在任何影响产品安全性和质量的泄漏风险，可保证产品在货架期内及使用过程中符合相应的理化及微生物质量要求。

1.探查微生物侵入的风险孔径

为了探查微生物侵入与其孔径的相关性，我们需要在一个合理的参数条件下加速微生物侵入，其理念可以参考稳定性研究中的影响因素试验，使用合理的加速条件，让微生物侵入能覆盖产品的全生命周期风险。

合理的加速条件是对微生物的种类、菌液浓度、培养基种类和暴露时间、压强等都可以进一步优化，同时匹配合理的侵入概率，则可以预测出无菌产品的全生命周期风险。

2.直接用微生物侵入作为CCIT的检查手段

在《药品GMP指南》2023年版中其在《无菌制剂上册》中第414页举例说明一个直接使用“微生物侵入试验法验证密封性实例”，使用的条件是-25kPa，维持3小时，恢复常压后再加正压25kPa维持3小时，再恢复常压后维持1小时，以考察是否有微生物侵入。

上述条件是一个较为剧烈的条件，目的是为了使得直接使用微生物侵入更加灵敏，此外，可以在微生物的种类、菌液浓度、培养基种类和暴露时间等都可以进一步优化，以获得更加灵敏的检出条件。

3.PDA TR86中列明MALL值的参数对应关系

参考PDA 2021年发布的：

Technical Report No. 86 Industry Challenges and Current Technologies for Pharmaceutical Package Integrity Testing，showing a MALL of 2 μm no matter which method is used. （无论使用哪种方法，MALL 均为 2 μm）。

在2019年Saeedeh Aliaskarisohi等人报道的汇总中显示，常见报道的MALL值如下表：

其他报道过的微生物侵入概率同条件的关系数据如下：

4微生物侵入的数据分析

综上，不同的微生物侵入概率，再搭配微生物种类、菌液浓度、培养基种类和暴露时间、压强等，即可对产品所可能遇到的微生物侵入风险做考察。

5.1 侵入概率

USP<1207>在 “5.产品包装质量要求和最大允许泄漏限度”章节中提出“大量已公布的研究，探索了硬包装与水溶液泄漏和/或微生物侵入风险之间的关系……在这个泄漏率下，微生物侵入的概率为＜0.10。选择这个保守的最大允许泄漏限度，将确保较低的微生物侵入和液体泄漏风险。”“对于其他容器系统，如，用弹性材料制造的系统……试验结果可用于对特定产品包装系统建立有意义的最大允许泄漏限度……一旦确立，最大允许泄漏限度就可以合理运用于类似的产品包装。”

一般而言，使用方风险定位10%，参考中国国家 标 准 化 管理 委员会, GB/T2828.1-

2 012 技术 抽样检验 程序 第1部 分 ：按 接 收 质量 限（ AQL）检 索 的 逐 批 检 验 抽 样 计 划 . 2012。因此基于此段描述，我们将微生物侵入概率为10%时对应的泄漏孔径，作为MALL（最大允许泄漏限度），是为合理。

5.2 数据统计

由于微生物侵入试验是“是与非”（英文可以翻译为hit/miss）的结果，且微生物侵入是一种“概率性”方法，因此需要引入统计学分析的方法。在USP相关参考引文和描述中，会要求做大量的阳性瓶和阴性瓶测试并统计分析。目前国际上发表的论文都是用统计学对微生物侵入结果进行分析。

USP<1207.1>在“4.4微生物侵入风险比较”章节中提出“在进行微生物侵入风险评估研究时，记住微生物侵入的概率性性质。为了获得最有意义的数据，应使用大量的阴性和阳性对照。”

在概率论和统计学中，二项分布（英语：Binomial distribution）是n个独立的是/非试验中成功的次数的离散概率分布，其中每次试验的成功概率为p。这样的单次成功/失败试验又称为伯努利试验。实际上，当n = 1时，二项分布就是伯努利分布。二项分布是显著性差异的二项试验的基础。

微生物侵入实验的结果为阴性（未侵入）或阳性（侵入），其特征符合Hit/Miss Data（命中/未命中）的适用范围。ASTM-E2862-18《Standard Practice for Probability of Detection Analysis for Hit/Miss Data》中推荐使用MIL-HDBK-1823A（简称mh1823）进行Hit/Miss Data的统计学分析。因此，微生物侵入结果使用mh1823软件（v6.0.4）进行统计学分析，可以计算出10%阳性（即微生物侵入）对应的破损孔径大小。

结语

当10%侵入概率过于严苛时，是可以释放做一些调整。但当大家都用同样的检测条件检测时，并使用统计学方式对结果进行分析，那么该结果的可靠性、可比性就可以有所保障。