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多管发酵法测水中总大肠菌群的方法

2018-08-13 点击 721 次

多管发酵法测水中总大肠菌群的方法

化工室:周琰

一、方法原理
  总大肠菌群是指那些能在37℃48h之内发酵乳糖产酸产气的、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽孢杆菌。主要包括有埃希式菌属、柠檬酸杆菌、肠杆菌属、等菌属的细菌。
二、标准溶液配制
  此方法无标准溶液
三、操作步骤
1、样品采集
  应采用在160~170℃灭菌2小时的玻璃瓶采样,采好的水样,应迅速送往实验室,进行总大肠菌群数检验。一般从取样到检验不宜超过2h,否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品,但不得超过6h。若超过会引起水样污染,从而影响监测结果。
  若医院污水经过氯消毒应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。
2、样品准备
  2.1、污水
    污水样品应至少取200mL,使用前应充分混匀。
    根据预计的污水样品中总大肠菌群数确定污水样品接种量。总大肠菌群数量相对较少的接种量一般为10mL、1mL、0.1mL。总大肠菌群数较多时接种量为1mL、0.1mL、0.01mL或0.1mL、0.01mL、0.001mL等。
    接种量少于1mL时,水样应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量为0.1mL、0.01mL时,取稀释比分别为1:10、1:100.其它接种量的稀释比依次类推。
1:10稀释样品的操作方法为:吸取1mL水样,注入到盛有9mL灭菌水的试管中,混匀,制成1:10稀释样品。因此,取1mL1:10稀释样品,等于取0.1mL污水样品。其它稀释比的稀释样品同法制作。
  2.2初发酵试验
在5只装有5mL已灭菌的三倍乳糖蛋白胨培养液的试管中(内有倒管),以无菌操作加入充分混匀的水样10mL;在5只装有10mL已灭菌的单倍乳糖蛋白胨培养液的试管中(内有倒管),以无菌操作加入充分混匀的水样1mL;在5只装有10mL已灭菌的单倍乳糖蛋白胨培养液的试管中(内有倒管),以无菌操作加入充分混匀的水样1mL1:10稀释的水样。置于37℃培养箱培养24h。
2.3平板分离
经初发酵试验培养24h后,发酵管颜色变黄为产酸,小玻璃倒管内有气泡为产气。将产酸产气及只产酸发酵管,分别接种于伊红美蓝培养基上,置于37℃培养箱培养18~24h。
2.4鉴定
    挑选可疑总大肠菌群菌落,进行革兰氏染色和镜检。可疑菌落有:1)深紫黑色,具有金属光泽的菌落;2)紫黑色,不带或略带金属光泽的菌落;3)深紫红色,中心色较深的菌落。
    上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌,则挑选上述典型菌落1~3个接种于普通乳糖蛋白胨培养液中,置于 37℃恒温培养箱培养24h。
2.4计数
根据证实有总大肠菌群存在的阳性管数,查表可得100mL污水中总大肠菌群MPN值,求出1L水中的总大肠菌群数
四、实际样品的测定
  医院污水中,不同程度的含有多种病毒、病菌、寄生虫卵和一些有毒有害物质,我国水污染防治法第二十条规定“排放含有病原体的污水必须经过消毒处理,符合国家有关标准后,方可排放”。二氧化氯被认为是一种安全高效强力杀菌剂,对水传播的病原微生物,包括病毒芽孢及水路系统中的异氧菌,硫酸盐还原菌和真菌等有很好的消毒效果。
  西安高新医院的污水执行《医疗机构水污染排放标准》具体限值见表一
      表一综合医疗机构和其它所有医疗机构污水污染物排放限制(日均值)

控制项目排放标准
总大肠菌群数(个/L)500个/L
pH6-9
总余氯(mg/L)3-10 mg/L  消毒接触池接触时间≥1h

2015年4月,对西安高新医院处理后排放污水中的总大肠菌群进行了监测。监测结果如下表:
              表二  总大肠菌群数测定

采样地点

西安高新医院

西安高新医院(平行样)

西安高新医院(平行样)

接种量及管数

10

1

0.1

10

1

0.1

10

1

0.1

各5管

各5管

各5管

初发酵

4

2

1

5

1

0

4

2

1

平板分离

4

1

1

4

1

0

4

1

1

复发酵

4

1

1

4

1

0

4

1

1

MPN值

21

17

21

总大肠菌群数个/L

210

170

210



五、结论
  西安高新医院的污水总大肠菌群数为210,完全符合《医疗机构水污染排放标准》中的限值。
六、注意事项
1)采好的水样,应迅速送往实验室,进行总大肠菌群数检验。一般从取样到检验不宜超过2h,否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品,但不得超过6h。
2)采样瓶必须提前灭菌,所使用的玻璃仪器都应高温灭菌。
3)革兰染色时要控制好每一步的时间。

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