原料乳及乳制品中三聚氰胺检测方法验证

原料乳及乳制品中三聚氰胺检测方法验证报告

GB/T22388-2008（第一法）

李晓东

一、方法概述
1 范围
本标准规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定方法。
本标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定。
2 原理
试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。
二、仪器与试剂
1.仪器
1.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器
1.2分析天平：感量0.0001g和0.01g
1.3固相萃取装置
1.4超声波振荡器
1.5氮气吹干仪
1.6涡旋混合器
1.7高速离心机：转速不低于4000r/min。
1.8具塞塑料离心管
1.9研钵
2. 试剂
除非另有说明，本方法所有实际均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
2.1甲醇(CH3OH )：色谱纯。
2.2乙腈(CH3CN) : 色谱纯。
2.3氨水：含量25%-28%
2.4三氯乙酸
2.5柠檬酸
2.6辛烷磺酸钠
2.7甲醇水溶液：准确量取50ml甲醇和50ml水，混匀后备用。
2.8三氯乙酸溶液（1%）：准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
2.9氨化甲醇溶液（5%）：准确量取5ml氨水和95ml甲醇，混匀后备用。
2.10离子对缓冲液：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约960ml水溶解，调节PH至3.0后，定容至1L备用。
3. 材料
3.1阳离子交换固相萃取柱:混合型阳离子交换萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg，3ml，或相当者。使用前依次用3ml甲醇、5ml水活化。
3.2定性滤纸
3.3海沙：化学纯，粒度0.65mm~0.85mm，二氧化硅（SiO₂）含量为99%。
3.4微孔滤膜：0.2μm，有机相。
3.5氮气：纯度≥99.999%
三、分析步骤
1.标准曲线绘制
1.1 三聚氰胺标品：纯度大于99.9%
1.2标准储备液：准确称取100mg（精确到0.1mg）三聚氰胺标准品于100ml容量瓶中，用甲醇水溶解并定容至刻度，配置成浓度为1mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。
1.3标准工作液：量取标准储备液适量，用甲醇水稀释成浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mLng/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL标准工作液。
2.样品的处理
2.1  提取
2.1.1液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
    称取2g（精确至0.01g）试样于50ml具塞塑料离心管中，加入15ml三氯乙酸溶液和5ml乙腈，超声提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25ml，移取5ml
滤液，加入5ml水混匀后做待净化液。
2.1.2 奶酪、奶油和巧克力等
    称取2g（精确至0.01g）试样于研钵中，加入适量海沙（式样质量的4倍-6倍）研磨成干粉状，转移至50ml具塞塑料离心管中，用15ml三氯乙酸溶液分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，再往离心管中加入5ml乙腈，余下操作同2.1.1中“超声提取10min，.......加入5ml水混匀后做待净化液”。
（注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化）
2.2 净化
将3.1中的待净化液转移至固相萃取柱中，依次用3ml水喝3ml甲醇洗涤，抽至净干后用6ml氨化甲醇溶液洗脱，整个固相萃取过程流速不超过1ml/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4g样品）用1ml流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供液相测试。
3.仪器测定条件
3.1色谱柱：C8柱，250mm×4.6mm，5μm，或相当者；
C18柱, 250mm×4.6mm，5μm，或相当者。
3.2流动相：C8柱，离子对试剂缓冲液-乙腈（85:15，体积比），混匀。
          C18柱，离子对试剂缓冲剂-乙腈（90:10，体积比），混匀。
3.3流速：1.0ml/min
3.4柱温：40℃
3.5波长：240nm
3.6进样量：20μl
四、结果处理
分析结果的表述
1、计算公式

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式中：X-试样中三聚氰胺的含量mg/kg；
C-标准溶液中三聚氰胺的浓度，μg/mL；
m-试样质量,g；
V-试样最终定容体积，mL；
f-稀释倍数。
五、验证结果
1.线性结果
将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中， 测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
Y=38040.6*X+2468.64  R^2=0.9999026

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表1 三聚氰胺标准系列试验结果

C（μg/mL）	0.5	1.0	5.0	10.0	25.0	50.0	100.0
A	32622	45831	178263	374953	971711	1886106	3812576

  以上结果表明三聚氰胺在0.5μg/mL ~100.0μg/mL范围内，R=0.9999513,吸光值与浓度呈线性关系，线性良好，符合要求。
2.检出限结果
将0.5μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出三聚氰胺的方法检出限为 0.1mg/kg，此检出限结果满足条件。
七、重复性测定
A.对样品F1807000285进行7次进样，其三聚氰胺测试值如下表所示：

编号	m（g）	C（μg/ml）	V（ml）	X(mg/kg)	X平(mg/kg)	RSD(%)
1	2.0231	11.609	1	28.69	28.85	0.33
2	2.0286	11.701	1	28.84
3	2.0304	11.747	1	28.93
4	2.0294	11.691	1	28.8
5	2.0300	11.745	1	28.93
6	2.0318	11.766	1	28.95
7	2.0272	11.677	1	28.85

本方法的精密度为 0.33% ，符合《原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定方法》GB/T22388-2008中给出的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
六、准确度验证（加标回收）
对样品JF180401228加标，取三聚氰胺浓度100 .0 μg/mL的标液 0.12mL、0.20mL和0.4ml同样品同步处理后，结果见下表

测定编号		三聚氰胺
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	X（mg/kg）	X平（mg/kg）	加标量（）	回收率%
1#	2.0211	1.0	N.D	N.D	N.D	/	/
2#	2.0187	1.0	N.D	N.D		/	/
加标1#	2.0236	1.0	11.747	29.03	/	24.71	97.91
加标2#	2.0224	1.0	20.491	50.66	/	49.45	102.45
加标3#	2.0312	1.0	38.246	94.15	/	98.46	95.62

由上表可以看出三聚氰胺的加标回收范围在 95.62%-117.48% ，RSD值为3.5%符合规定要求。
七、总结
本方法的检出限为0.1mg/kg。小于GB/T22388-2008中给出的最低检出浓度2mg/kg。本方法的精密度为 0.33%，符合《原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定方法》GB/T22388-2008中给出的精密度要求.通过对原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺测定方法的检出限、精密度和准确度的评价，本方法测定三聚氰胺数据准确，结果可信。此方法的准确性好，测定结果真实可靠，可用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的测定。

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