中国农科院蔬菜所刘肃研究员系列讲座（一）：农产品样品前处理

       样品前处理也称之为样品预处理，是指将样品分解，使被测组分定量地转入溶液以便进行分析测定的过程。在样品制备（采集）后的下一步骤就是样品前处理。完整样品分析过程中，样品前处理占用了大部分的时间，有的可以占到全程时间的70%，甚至更多。比样本本身的检测分析多了近一半的时间。因此，样品前处理方法和技术应值得关注。由于样品前处理关乎到整个实验的成败，许多前处理细节如不加以注意，很容易对实验结果产生影响。为此，我要测网编辑特专访中国农业科学院刘肃研究员对实验人员普遍关注的实验室预处理的操作及注意事项做详细讲解。

       刘肃，中国农业科学院蔬菜花卉研究所研究员。现任食品安全国家标准审评委员会农药残留方法组副组长，农业部农产品质量安全专家组专家，农业部农药残留重点实验室学术委员会委员，全国蔬菜质量标准中心专家委员会委员，从事全国蔬菜标准、农药残留检测方法标准的研究、制定和审定以及实验室管理工作。

       样品前处理主要分为称量、提取、过滤、浓缩、净化等步骤。

       第一步：称量。

       称量是指测量物质质量的过程。称量样品时需要使用天平。应当注意，天平室的温度在18℃-30℃之间，室内不能有空气流动。因此，一间规范的天平室都是有隔断的。

       使用前应先检查天平的水平，打卡开后进行预热后使用。刘肃研究员提到，称量所选天平的感量，可根据结果计算要求的有效位数决定。在实验室常规检查中，经常看到，有些单位所有的样品称量都选用万分之一的天平称量，一台天平“称万物”，即无论样品的质量如何，都使用同一量程的天平。实验员都能理解被称量物体的质量不能超过量程最大值，但都会忽略最小感量。通常在做农残样品检测时，称样量为10g，如果选用2000g的感量天平，则会产生较大的误差，此时需要使用更小感量的天平。

       需要注意的是，在称量前，一定要先将样品搅拌均匀。在对第三方检测机构检查时，会常常见到没有这一步的操作，直接用称量勺取样品。标准物质在称量的时候，也存在几处不正确的操作。标准物质的质量非常小，通常为毫克级，很多实验人员依旧使用称量纸进行称量，随后再转移到容量瓶里；或者直接使用称量瓶进行称量。标准物质定容体积以10mL居多，直接使用容量瓶称量，因瓶口过小，很难将浓度定容准确。正确且简单的操作：直接使用烧杯称量。

       此外，有些化学试剂，像易吸水潮解的NAOH不能放在称量纸上称量，也要放在烧杯中称量。带玻璃门的天平，需要关上玻璃门后读数。

       最后，样品称量时应注意有代表性，尽量使用较大的称量勺，以减少样品间的差异。称量时应尽量使用开口较大的容器，如烧杯，避免样品沾到容器壁上。

       第二步：提取。

       标准中规定，一般20个样品为一批次，每批次至少做一个质控样。无论是针对农残样品还是兽残样品，称取后需加标准溶液制备质控样，标准溶液在量取时一定要使用吸量管，质控样在加入标准溶液后，涡旋振荡一分钟，让标准溶液充分溶解到样品中，静置30min后，再加入提取剂。

       提取的方法有很多种，针对作物或者动物组织，通常选择组织捣碎法，又称匀浆提取法，优点是简便、快速、效果好。一般操作是样本加提取剂后高速搅碎，使溶剂与微细试样反复紧密接触、萃取，从而提取出检测成分的方法。震荡提取法适用于多样品，操作简便，但提取效率有时不高。索式提取法原理是将样本放入提取器滤纸筒中，选用适当溶剂，利用虹吸原理连续提取检测成分的提取方法。效率高，但缺点是操作繁琐，很少用。ASE（加速溶剂萃取）加速溶剂萃取或加压液体萃取是在较高的温度和压力下用有机溶剂萃取固体或半固体的自动化方法，如土壤样品适合次提取方法。超临界萃取（SPE）。使用超临界的优点是环保，利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行。但速度较慢，使用并不是非常广泛。超声辅助提取：超声波的机械波有效频率，产生的空化、振动、粉碎、搅拌等综合效应应用到天然产物提取成分工艺中，通过破坏细胞壁。达到提取细胞内容物的过程。因超声波的机械波长对人体有害，因此在超声提取过程中，避免实验人员长时间停留在超声波提取仪前。

       提取处理方法参照相关标准操作即可。对于汁液多的酸性样品，如果汁，在提取前应先调pH，含水少的样品，如大米、大豆、花生、茶叶等，均质前先加水润湿膨胀样品，静止30分钟后再提取。

       第三步：过滤。

       过滤是常见的前处理操作，尽管现在基本已经采用离心方法代替。常用的简单滤纸过滤，将滤纸两次对折叠成90°呈圆心角状，将三层的一侧撕去一角，目的是让滤纸更贴合漏斗。放入漏斗内时，滤纸边要低于漏斗边5mm，试样沿玻璃棒向漏斗口内倒入，试样体积不要超过滤纸高度的3/4。过滤时漏斗应置于漏斗架上。值得注意的是，很多实验室都会直接将漏斗放在接收容器上，这是非常容易犯的错误。

       抽滤。将装有5g-7g氯化钠的100mL具塞比色管放入低口瓶中，并在瓶口盖上橡胶垫，插入布氏漏斗，铺上滤纸，用少量水润湿，开启减压装置，将试样匀浆倒入布氏漏斗中抽滤。在前处理方法中，无论是老方法还是新的QuEChERS法，都少不了盐析，注意加盐的目的是让有机相与无机相进行分层，因此QuEChERS法一定在提取步骤后加盐。如加盐量不足，或振摇不够未使盐充分溶解都会造成乙腈和水分离不充分，造成极性农药回收率低。摇匀过程中如发生乳化现象，则长时间静置或者加少量试验用水，直到分层清晰，或采用离心方法。静置时间应足够，不小于30min.且在静置过程中，应不时轻摇容器，使器壁上的水珠下落。或者也可采用速度较快的离心方法。

       第四步：浓缩。

       旋转蒸发器：边减压边旋转，浓缩速度快，且回收率高。注意玻璃零件在安装使用前需清洗干净、烘干或者擦干。接头或者各个磨口部位需要涂真空脂。水浴通电前必须加水，严禁无水干烧。

       气流吹蒸浓缩装置（氮吹法）适用于体积小、易挥发的提取液，但对于蒸汽压较高的农药，容易损失。

       浓缩注意事项

       使用旋转蒸发器时，应注意水浴温度不宜过高，一般不超过40℃，浓缩液的体积不应超过浓缩瓶体积的1/2，否则容易造成爆沸；使用旋转蒸发器时，尽量选择冷却循环系统，冷却温度控制在5℃以下，保证回收率。

       使用氮吹仪浓缩时，加热温度不宜过高，按照标准要求控制温度，但其流量也不能过大，不能将样品吹干，在近干状态下取离水浴锅，自然晾干。若是易氧化的样品，则必须使用氮气，否则会导致某些农药回收率偏低。氮吹时，氮吹管不能离液面太近，防止污染。

       第五步：净化。

       净化的方法有很多，如液液分配法、柱层析法、固相萃取法、分散固相微萃取法、出扫蒸馏法、凝结剂沉淀法和薄层色谱法等。使用最多的，固相萃取法和分散固相微萃取法。

       固相萃取：1、柱子预处理（固定相活化）是创造一个与样品溶剂相容的环境并去除柱内所有杂质。需要注意的是，终溶剂不应强于样品溶剂，若使用太强的溶剂，将降低回收率。还应注意固定相不能抽干，以免因为导致填料床出现裂缝，从而得到低的回收率和重现性，样品也没有得到应有的净化。过分干燥会造成目标化合物的流失。2、样品过柱，为了保留分析物，溶解样品的溶剂必须较弱。如果溶剂太强，分析物则不会被保留，结果回收率会很低。因此需要尽可能使用最弱的样品溶剂。3、固相萃取柱洗涤时，淋洗液不应是太强的溶剂，否则将强保留杂质西峡来，如果使用太弱溶剂，则会使淋洗体积增大。可改用强弱试剂混用，但混用或前后使用的溶剂必须互溶。4、固相萃取柱干燥。柱子干燥的目的是去残留的水分及水溶性干扰物。对于GC或GC/MS，样品中过多的水分会对分析柱造成致命性的损害。一般在真空或加压条件下，3min-5min的干燥时间足够。如果最后的洗脱剂为缓冲溶液或者水溶性有机溶剂，而且分析手段为反相HPLC,SPE柱上的水分对目标化合物的洗脱影响不大，可以省略柱子干燥这一步骤。5、洗脱。淋洗过后，将分析物从固定相上洗脱下来。洗脱剂对目标化合物必须有足够的洗脱强度以便于尽可能小的体积将目标化合物洗脱下来。这样洗脱组分中目标化合物的浓度高，无需再进行浓缩或简单浓缩就可以进行下一步分析。洗脱剂必须有足够的选择性，将目标化合物洗脱下来，把保留性强的杂质留在柱子上。如果样品基质复杂，为了选择性的洗脱目标化合物，洗脱剂的强度尽可能低。还需要注意洗脱剂应尽可能与分析仪器相适应，以便方便下一步的分析。

       以往的提取和净化方法基本上是加入乙腈后用高速组织匀浆后静置或离心，取上清浓缩后用固相萃取柱净化，上机测定。目前应用比较多的前处理方法是QuEChERS方法，其原理是分散固相萃取，减少浓缩步骤。

       检测前最后的一个处理时是过滤膜，需要注意的是有的滤膜对组分有很大的吸附作用，造成回收率低。因此在使用滤膜前，应进行验证，检查是否会对组分产生吸附。如果有吸附，有两种克服方法，一是更换厂家，选择吸附少的滤膜，二是不用过滤膜，用高速离心的方法，离心转速10000r/min。