能力验证：牛乳中黄曲霉毒素M1和铅测定

　　黄曲霉毒素M1和铅是乳品质量安全中重要的安全指标，也是生鲜乳质量安全监管和风险评估研究中重点关注的风险因子，检测数据的准确性和科学性直接影响对牛乳的品质和安全性的判定和评估。能力验证是利用实验室间比对来确定实验室能力的活动，也是为确保实验室维持较高的校准和检测水平而对其能力进行考核、监督和确认的一种验证活动，通过能力验证活动可以检验实验室检检测水平和能力，是评价、判断、监控和提升实验室能力的有效手段之一。

　　一、牛乳中黄曲霉毒素M1的测定

　　1.奶产品中黄曲霉毒素M1的限量我国GB 2761-2011 《食品安全国家标准 食品中真菌毒素的限量》中明确规定牛乳中黄曲霉毒素M1的限量为0.5µg/kg，与美国、日本一致，欧盟成员国以及与欧盟有贸易部分国家相对严格，为0.05µg/kg，而欧盟对婴幼儿配方食品，包括婴幼儿配方牛奶则限量0.025µg/kg。

　　2.黄曲霉毒素M1的检测方法 目前现有黄曲霉毒素M1检测方法有薄层色谱法、酶联免疫法、荧光光度法、液相色谱法、液质联用法等。我国现行有效的标准有GB 5413.37-2010《食品安全国家标准 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定》、GB 5009.24-2010《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定》、GB/T 23212-2008《牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定 液相色谱-荧光检测法》、SN/T 1664-2005 《牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2含量的测定》等。牛乳中黄曲霉毒素M1的测定主要推荐使用GB 5413.37-2010中的第一法(液质联用免疫亲和层析净化法)和第二法(高效液相色谱免疫亲和层析净化法)。这两种方法都适用，但从日常检测经验来看，液相法定量方面优于液质法，且操作相对简单、仪器普及率高，牛乳中黄曲霉毒素M1的测定推荐使用第二法。

　　3.液相色谱免疫亲和柱净化法1)样品前处理

　　A准确称样:牛乳取50 mL(g)以上,奶粉称取10 g左右，取样量一定按照标准要求操作。

　　B复原：奶粉需用50℃温水50 mL复溶，完全溶解，不能有结块，冷却至室温后定容至100 mL。

　　C离心去脂：样液在4 ℃下以10000转/min转速下冷冻离心15 min，完全去除脂肪，吸取清液，操作过程中不得混入脂肪。

　　D净化、浓缩：应注意冷藏保存的免疫亲和柱需恢复至室温，并检查柱效，柱效应大于80 %，且上样过程中免疫亲和柱不能流干;流速一般控制在2-3mL/min;水洗后需抽干，用3mL甲醇洗脱收集，氮气吹至近干，用10%乙腈水溶液定容至1mL。

　　2)色谱条件

　　色谱柱： C18 4.6×150mm,3.5-5Micron 。

　　流动相：乙腈-水(25：75)

　　流速： 0.8ml/min 。

　　进样量：30.0 uL。

　　柱温：25℃。

　　检测器：荧光检测器;

　　激发波长365nm，发射波长435nm;

　　图1黄曲霉毒素M1标样图谱

　　图2 牛乳样品中黄曲霉毒素M1图谱

　　3)能力验证中注意事项

　　样品贮存：拿到能力验证考试样后，如果不马上做应放入冰箱4°C保存;

　　标准物质：应使用有证标准物质，biopure(ROMER)、色谱科(SUPELCO)等有证标准溶液都可以，贮备液用乙腈配置，工作液标样直接用流动相配制;

　　洗脱步骤：免疫亲和柱的使用按照各厂家说明书操作。洗脱液一般使用色谱纯的试剂。

　　样品质控：1)添加回收;2)实物标样;

　　取样：离心后取清液时，注意不要将离心后的脂肪层混入。

　　浓缩：注意氮吹的流量和温度，氮气流量不可太大。

　　阳性样本：日常检测中留意保留阳性样本，作为质控参考。

　　二、牛乳中铅的测定

　　1.我国牛乳中铅的限量要求GB 2762-2012《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中明确规定铅含量不得超过0.05mg/kg。

　　2、铅的检测方法目前现有铅的检测方法有石墨炉原子吸收光谱法、氢化物原子荧光光谱法、火焰原子吸收光谱法、二硫腙比色法、单扫描极谱法等。现行有效的标准主要为GB 5009.12-2010《食品安全国家标准食品中铅的测定》，牛乳中铅的测定主要推荐使用GB 5009.12-2010中的第一法(石墨炉原子吸收光谱法)和第二法(氢化物原子荧光光谱法)，从日常检测经验来看，第一法更适用于测定牛乳中的铅。

　　3、牛乳中铅的测定操作注意事项1)空白试验

　　铅的测定过程中需做试剂空白实验，为了有效控制试剂空白处于较低水平，对测定结果不产生不良影响，一般需要注意两个方面：

　　器皿的清洗——实验过程中需要用到的所有器皿都应在(1+5)的硝酸中浸泡过夜，用水反复冲洗，最后用去离子水冲洗干净后方可投入使用。

　　试剂纯度及水的要求——测定过程中使用的水应为GB/T6682规定的一级水，使用的硝酸、高氯酸应为优级纯或以上，并对所使用的酸作为关键性试剂进行验收。

　　2)前处理方法的选择

　　压力消解罐消解法，湿式消解法，微波消解，石墨消解——使用浓酸量相对比较大(5-10 mL不等),不利于试剂空白值的控制;在溶液的转移过程中需要溶剂清洗容器内壁，使得转移后溶液的定容体积会较大(至少25 mL)，上机液浓度将会更低，不利于仪器的准确读数，对于低含量的样品，建议选用干法灰化进行前处理。

　　干法灰化——可适当提高取样量，水浴上蒸发去除大部分水分再转移至平板电炉上炭化至无烟，再转移至马弗炉中灰化。灰化时需注意灰化温度不宜过高(标准要求500±25 ℃)，否则有可能导致铅在灰化过程中挥发损失，导致测定结果偏低。

　　3)上机测定

　　上机读数前，应对仪器做必要的检查和调整，如进样针的位置、进样深度、进样速度，以及是否将气泡赶尽，保证进样体积的准确等。做好空心阴极灯的预热工作，并关注增益的情况，增益过大易导致读数稳定性差。

　　特征谱线的选择——铅的特征谱线中响应值最高的为217.0nm，考虑到217.0nm附近背景干扰比较大，故多选择次灵敏谱线283.3nm，牺牲部分灵敏度，但可以有效控制噪声。

　　石墨管——新的石墨管使用前应先进行老化处理，以达到稳定的工作状态，当石墨管升温次数过大后，会导致仪器的响应值下降，影响灵敏度，应及时进行更换。

　　升温程序——大多数的仪器都给出了推荐的升温程序，必要的时候可对其进行适当的调整，根据进样量设定足够的干燥温度，避免溶液在升温过程中爆沸飞溅，导致读数不稳定，原子化读数后最好能加入高温清洗步骤，避免前后两个样品间的交叉污染。

　　多次测定——石墨炉原子吸收的读数稳定性不够，建议对同一样液多次读数，以避免单次读数的偶然性。

　　标准曲线——应根据样液浓度水平合理确定标准曲线的范围、布点，对于牛乳样品，应适当增加标准曲线下段的标准点密度。每测定10到20个样品后，应插入标准曲线校验点，对标准曲线的斜率进行确认，若变化较大，应重新绘制标准曲线。

　　4)干扰的消除

　　背景吸收——当元素灯所发出的特征谱线被分子或固体颗粒遮挡发生能量衰减，即产生了背景吸收。为了扣除背景吸收，一般普遍采用的方法为氘灯校正或塞曼校正，对于283.3 nm，这两种方法都能覆盖，扣背景效果无显著差异。

　　基体改进——添加基体改进剂是避免待测元素在原子化阶段前损失，从而提高读数稳定性、重现性的有效手段之一。测定铅含量时，常用的基体改进剂有磷酸二氢铵(浓度为250 g/L)、硝酸镁(2.5 g/L)、钯溶液(硝酸钯或氯化钯，2 g/L)，其中，磷酸二氢铵可有效消除Cl-干扰，在灰化阶段磷酸二氢铵受热分解产生H2，与Cl-结合形成HCl挥发，同时形成还原性的氛围从而减少铅与Cl-形成氯化物损失，钯和镁则能够与铅形成牢固的共价键，使铅能够承受更高的灰化温度，去除干扰，到原子化阶段再气化形成吸收峰。

　　标准加入法——是有效避免基体干扰的方法之一。

　　5)质量控制

　　针对原子吸收法测定铅含量，实验室经常采用的质量控制手段如下：

　　加标回收——加标回收率的测定可以反映测试结果的准确度。当按照平行加标进行回收率测定时，所得结果既可以反映测试结果的准确度，也可以判断其精密度。

　　实物标准样品——使用实物标样，可以对检测的整个过程进行评估。对于乳制品，常用的有证实物标准样品有GBW08509a(脱脂奶粉成分分析标准物质)、GBW10017(生物成分分析标准物质-奶粉)、1849a(Infant/Adult Nutritional Formula)。

　　质量控制图——积累对于同一稳定样品(最好为有证实物标准样品)20次以上的测定结果，绘制均值-标准差控制图，单值-移动极差控制图，随着质控数据的不断积累，从而实现对该参数检测工作质量的动态监控。

　　三、如何开展和应对能力验证

　　1.开展能力验证的主要环节人、机、料、法、环是对全面质量管理理论中的五个影响产品质量的主要因素的简称，也是实验室质量管理的核心，直接影响检测结果。实验室日常检测和能力验证活动都围绕五个环节开展相关工作。

　　2.应对能力验证建议1)在正式考核前，应对检测各环节进行确认。

　　2)确认考核的形式。

　　3)针对考核形式设计相应的质控方案。

　　4)在时间允许的情况下尽可能多次检测，尽量充实数据。

　　5)每批次检测多做几组空白、空白加标、样品、样品加标及质控样。

　　6)有条件的实验室可以选择使用不同仪器进行验证。

　　7)检测的过程要留意异常情况。

　　8)上报结果前要充分考虑质控数据，进行必要的数据处理。