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川贝母聚合酶链式反应检测
适用范围:
服务领域:药品
服务地点:其他

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聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性方法。   

模板DNA提取 取本品0.1g,依次用75%乙醇1ml、灭菌超纯水1ml清洗,吸干表面水分,置乳钵中研磨成极细粉。取20mg,置1.5ml离心管中,用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA[加入缓冲液AP1 400μl和RNA酶溶液(10mg/ml)4μl,涡漩振荡,65℃水浴加热10分钟,加入缓冲液AP2 130μl,充分混匀,冰浴冷却5分钟,离心(转速为每分钟14000转)10分钟;吸取上清液转移入另一离心管中,加入1.5倍体积的缓冲液AP3/E,混匀,加到吸附柱上,离心(转速为每分钟13000转)1分钟,弃去过滤液,加入漂洗液700μl,离心(转速为每分钟12000转)30秒,弃去过滤液;再加入漂洗液500μl,离心(转速为每分钟12000转)30秒,弃去过滤液;再离心(转速为每分钟13000转)2分钟,取出吸附柱,放入另一离心管中,加入50μl洗脱缓冲液,室温放置3~5分钟,离心(转速为每分钟12000转)1分钟,将洗脱液再加入吸附柱中,室温放置2分钟,离心(转速为每分钟12000转)1分钟],取洗脱液,作为供试品溶液,置4℃冰箱中备用。另取川贝母对照药材0.1g,同法制成对照药材模板DNA溶液。    PCR-RFLP反应 鉴别引物:5'CGTAACAAGGTTT-CCGTAGGTGAA3'和5'GCTACGTTCTTCATCGAT3'。PCR反应体系:在200μl离心管中进行,反应总体积为30μl,反应体系包括10×PCR缓冲液3μl,二氯化镁(25mmol/L) 2.4μl,dNTP(10mmol/L)0.6μl,鉴别引物(30μmol/L)各0.5μl,高保真Taq DAN聚合酶(5U/μl)0.2μl,模板lμl,无菌超纯水21.8μl。将离心管置PCR仪,PCR反应参数:95℃预变性4分钟,循环反应30次(95℃30秒,55~58℃30秒,72℃30秒),72℃延伸5分钟。取PCR反应液,置500μl离心管中,进行酶切反应,反应总体积为20μl,反应体系包括10×酶切缓冲液2μl,PCR反应液6μl,Sma I(10U/μl)0.5μl,无菌超纯水11.5μl,酶切反应在30℃水浴反应2小时。另取无菌超纯水,同法上述PCR-RFLP反应操作,作为空白对照。    

电泳检测 照琼脂糖凝胶电泳法(通则0541),胶浓度为1.5%,胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed;供试品与对照药材酶切反应溶液的上样量分别为8μl,DNA分子量标记上样量为lμl(0.5μg/μl)。电泳结束后,取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中,在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上,在100~250bp应有两条DNA条带,空白对照无条带。